Laporan Fieltrip 2018 Karantina makassar

LAPORAN FIELDTRIP

MANAJEMEN KESEHATAN PEMBENIHAN IKAN

(PENANGGULANGAN PENYAKIT)

Dosen                   : Suryati, S.Pi., M.Si

Modul         : 6.3.1 Teknik Diagnose Penyakit Virus  Mrnggunakan Metode PCR 

Laboran      : Seniati

OLEH

ALVIANUS MA’DIKA

1622010316

PEMBENIHAN

BUDIDAYA PERIKANAN

POLITEKNIK PERTANIAN NEGERI PANGKEP

2018

  BAB I

PENDAHULUAN

A.    Latar Belakang

Salah satu penyakit yang berbahaya dengan tingkat kematian tinggi dan penyebaran yang luas adalah penyakit yang disebabkan virus. Virus mampu menyerang ikan air tawar, payau, maupun ikan laut dalam berbagai stadia. 

Virus adalah mikroorganisme yang dapat menyebabkan penyakit dengan ukuran tubuh antara 25-300 nanometer, sehingga hanya dapat dilihat menggunakan microskop elektron. Virus tidak mempunyai perlengkapan metabolik sendiri dan tidak mampu membangkitkan energi atau mensintesis protein, sehingga kebutuhan pakan untuk memperbanyak diri sangat bergantung pada inangnya.  Pada saat itulah virus menyebabkan kerusakan ataupun penyakit pada inangnya (Pelczar dan Chan, 1988). Salah satu cara yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi penyakit akibat adanya virus atau bakteri adalah dengan menggunakan metode PCR. Metode ini merupakan salah satu teknik molekular dalam diagnosa penyakit.

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini dikembangkan pertama kali oleh Kary B. Mulis pada tahun 1985. Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam  manipulasi dan analisis genetic. Pada awal perkembanganya metode ini hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitas molekul mRNA. 

1.2  Tujuan

Untuk mengetahui cara mendiagnosa penyakit virus dengan menggunakan metode PCR.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A.    Pengertian PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan metode untuk amplifikasi potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari jumlah nanogram dari DNA template. Proses ini mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif.

B.     Cara Kerja PCR

Ada 3 tahap dalam kerja PCR, yaitu:

·         Denaturing adalah proses memisahkan 2 untai pilinan DNA. Selama proses denaturasi, double stranded DNA akan membuka menjadi single stranded DNA. Hal ini karena suhu tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa nitrogen yang komplemen. Tahap ini berlangsung sekitar 1 hingga 2 menit. Seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90 ^oC – 95 ^oC.

·         Annealing( Penempelan Primer) adalah tahapan dimana primer forward dan reverse mencari pasangannya di untai-untai DNA. Jika cocok maka primer akan melekat.Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada template selama 1-2 menit. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50 ^oC – 60 ^oC. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72 ^oC.

·         Reaksi Polimerisasi (extension) Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72 ^oC selama 1 menit. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan template oleh DNA polimerase.

BAB III

PELAKSANAAN

A.    Waktu  dan  Tempat

Hari/tanggal    :

Pukul               : 07.00-Selesai

Tempat            : Balai besar karantina ikan dan pengembangan mutu ikan, Makassar.

B.     Metode Karantina Ikan

Metode Pengumpulan Data, Metode yang di gunakan dalam kunjungan ini adalah wawancara. Wawancara merupakan cara pengumpulan data dalam bentuk Tanya jawab/diskusi dengan pembimbing, teknisi, staf pegawai dan pihak-pihak lain yang kompeten dalam bidangnya.

Adapun sumber data yang digunakan adalah sebagai berikut :

-      Data primer Yaitu data yang bersumber dari dalam Balai Besar Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Makassar berupa wawancara terhadapbeberapa karyawan dan pada beberapa referensi yang diambil di internet.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A.    Hasil

Virus yang telah di diuji dibalai karantina dan pengembangan mutu ikan di Makassar salah satunya yaitu:

·         KHV

·         VNN

·         WSSV

B.     Pembahasan

Diagnosa Virus, Saat ini telah dikembangkan berbagai metode diagnosis virus diantaranya metode konvensional seperti histopatologi, dotblot, hibridisasi, in situ dan PCR dan RT-PCR. Metode diagnosis dengan PCR mungkin merupakan salah satu metode yang cepat dan menjanjikan tingkat akurasi yang tinggi dibandingkan metode lain. Sampel dapat disiapkan dalam awetan alkohol 70% dalam potongan kecil (0,5 cm), untuk PCR dan penggunaan formalin 10% untuk pemeriksaan histopatologi (Nguyen, 1997).

Tahap-tahap mendiagnosa virus menggunaka metode PCR adalah sebagai serikut:

Ø  Isolasi dan ekstraksi DNA dan RNA

Setelah diidentifikasi, sampel kemudian dibedah pada bagian tertentu sesuai jenis ikan dan target yang biasa di serang oleh virus tersebut. Tidak semua sampel yang dibedah namun hanya satu.Sampel yang didapatkan akan diekstraksi untuk mendapatkan materi genetiknya (RNA atau DNA) yang ada kemudian dilarutkan dengan 200 µl ddH₂O (aquabides).

Ø  Amplifikasi

Amplifikasi merupakan reaksi pelipatgandaan cDNA target secara in vitro sehingga dapat dideteksi dengan elektroforesis (Anonim, 2011). Pada proses amplifikasi terjadi beberapa tahapan yakni denaturasi, annealing dan pemanjangan dimana semua proses tersebut dipengaruhi oleh suhu dan waktunya.

Ø  Elektroforesis

Menurut Prasetyo (2009) elektroforesis adalah perpindahan molekul yang bermuatan sebagai respon terhadap medan listrik. Angka perpindahan tergantung pada kekuatan medan listrik, muatan listrik, ukuran dan bentuk molekul, kekuatan ionik, viskositas, dan suhu medium yang digunakan oleh molekul tersebut untuk berpindah. Ada bermacam-macam zat kimia yang digunakan sebagai gel di dalam proses elektroforesis. Penggunaan jenis gel disesuaikan dengan tujuan yang akan dicapai. Pada kesempatan ini hanya dua cara yang digunakan dalam proses elektroforesis yaitu elektroforesis gel agarose (AGE).

Ø  Visualisasi Pita DNA

Pembacaan pita DNA yang terbentuk dengan menggunakan UV transilluminator dilakukan dengan membandingkan pergerakan pita pada sampel dengan kontrol positif dan negatife.

Jenis virus yang telah diuji

·         KHV (Koi herpes virus)

Koi herpesvirus (KHV) adalah virus yang menginfeksi ikan mas dan koi dan bersosiasi dengan kematian massal (Hedrick et al. 2000).

·         VNN (Viral nervous necrosis)

Viral Nervous Necrosis (VNN), adalah jenis virus Nodaviridae yang menyerang ikan kerapu, terutama pada stadia larva dan benih. VNN dapat menyebabkan kematian massal hingga mencapai prevelensi 100% (Johnny et al., 2010; Suratmi dan Ni Luh, 2008).

·         WSSV (White Spot Syndrome Virus)

WSSV adalah virus yang menyerang sistem organ dari krustasea yang menyebabkan bercak putih pada permukaan eksternal udang hingga  menyebabkan kerugian berupa kematian yang tinggi (mortalitas) mencapai 100%.  Udang yang terserang penyakit ini dalam waktu singkat udang dapat mengalami kematian yang sangat tinggi.  WSSV merupakan virus yang disebabkan oleh virus SEMBV dan termasuk golongan virus berbahan genetik DNA (Dioxyribonucleic Acid) berbentuk batang (Bacilliform).

BAB V

PENUTUP

A.    Kesimpulan

Adapun kesimpulan dari laporan ini yaitu:

·         PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan metode untuk amplifikasi potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.

·         Ada tiga tahap cara kerja PCR : Denaturing, Annealing( Penempelan Primer) dan Reaksi Polimerisasi (extension).

·         Tahap-tahap mendiagnosa virus menggunaka metode PCR yaitu:

ü  Isolasi jaringan

ü  Amplifikasi

ü  Elekroforisis

ü  Vitasualisassi pita DNA

·         Jenis-jenis virus yang telah diuji: KHV, VNN dan WSSV.